• ۱۳۹۸/۰۵/۱۶ ۱۹:۰۴:۵۵
  • در آموزش یونجه
  • توسط aranjbarha
  • بازدید: 39
  • اخرین ویرایش: ۱۳۹۸/۰۵/۱۷ ۱۳:۰۸:۱۵
  • چاپ نوشته هاچاپ پی دی اف

ژنتیک یونجه

مطالعه ساختار و تنوع ژنتیکی جمعیت های یونجه زراعی (Medicago sativa L.) با استفاده از نشانگرهای ISSR 
(حیدر عزیزی، ایرج برنوسی، بابک عبدالهی مندولکانی، رضا درویش زاده)

چکیده
استفاده از منابع ژنتیکی در اصلاح گیاهان نیازمند مطالعه دقیق تنوع ژنتیکی جمعیت های گیاهی است. به این منظور ساختار و تنوع ژنتیکی 80 ژنوتیپ از 8 جمعیت مختلف یونجه زراعی (Medicago sativa L.) با استفاده از نشانگرهای ISSR مورد بررسی قرار گرفت. 16 آغازگر مورد استفاده 117 مکان امتیازبندی تولید کردند که از این تعداد 91 مکان در بین و درون جمعیت ها چند شکل بودند. میانگین مقادیر PIC ( Polymorphic information content ) برای آغازگرهای مورد استفاده 77/0 و از 65/0 (آغازگر UBC849) تا 93/0 (آغازگر 443) متغیر بود. دندروگرام حاصل از تجزیه کلاستر به روش UPGMA مبتنی بر ضرایب فاصله ژنتیکی نیز، جمعیت ها را در سه کلاستر اصلی قرار داد. بیشترین و کم ترین فاصله ژنتیکی بین جمعیت ها به ترتیب 128/0 (قره یونجه ملک کندی و همدانی) و 054/0 (ترکیه ساکوئل و بغدادی) بود. متوسط میانگین هتروزیگوسیتی در جمعیت های مورد مطالعه 285/0 و از 267/0 (بغدادی) تا 309/0 (ترکیه ساکوئل و محلی اصفهانی) متغیر بود. نتایج ها (91 درصد) در مقایسه با بین جمعیت ها (9 درصد) نشان داد. تجزیه کلاستر براساس روش Complete Linkage مبتنی بر ضرایب تشابه دایس، ژنوتیپ های مورد مطالعه را در 6 گروه هتروتیک قرار داد. جمعیت هایی با فاصله ژنتیکی مناسب یا افراد متعلق به گروهای هتروتیک مختلف می تواند به طور بالقوه به عنوان والدین تلاقی در برنامه های اصلاحی یونجه مورد استفاده قرار گیرند. 

مقدمه
یونجه (Medicago sativa L.) یکی از مهم ترین گیاهان علوفه ای ایران و جهان به شمار می رود که از قفقاز، شمال غربی ایران، ارتفاعات ترکمنستان و شمال شرقی ترکیه منشاء یافته است (28). علیرغم اهمیت زراعی این گیاه، پیشرفت های حاصل از برنامه های اصلاحی در این گیاه بخاطر توارث تترازومی، پسروی خویش آمیزی شدید و پیچیدگی ساختار ژنتیکی آن نسبت به گیاهان دیگر چندان چشمگیر نبوده است. از طرف دیگر به خاطر میزان زیاد دگرگشنی، گرده افشانی باز و اینترگرسیون بین گونه های M. falcata با M. sativa ، یونجه گیاه بسیار هتروزیگونی است که تنوع ژنتیکی زیادی در بین ارقام آن دیده می شود. وجود چنین اختلاف ژنتیکی گسترده در بین افراد جمعیت یونجه، مطالعات مربوط به ژنتیک جمعیت این محصول را پیچیده تر نموده است (28، 30). استفاده از منابع ژنتیکی در برنامه های اصلاحی نیازمند مطالعه دقیق تنوع ژنتیکی جمعیت های گیاهی است. این موضوع بویژه در مورد یونجه برای تولید ارقام ساختگی مهم می باشد زیرا که تولید ارقام ساختگی مبتنی بر انتخاب والدین متنوع و دارای عملکرد مطلوب بوده تا در نتیجه آن، حداکثر هتروزیس در نتایج حاصل گردد (3، 8). از طرف دیگر اطلاع از میزان چند شکلی یا تفاوت بین نمونه های مختلف، به منظور کاهش حجم نمونه های ذخایر توراثی نگهداری شده در بانک ژن و بررسی خلوص بذر به خصوص در گیاه دگرگشنی مانند یونجه بسیار مفید خواهد بود. درک تغییرات ژنتیکی و تنوع ارقام محلی یونجه و مشخص نمودن خصوصیات مهم زراعی آن ها فرصتی ایجاد خواهد کرد که اصلاح کنندگان یونجه با توجه به شاخص های مورد نظر خود به اصلاح این محصول مهم با دقت و آگاهی بیشتری اقدام نمایند. چنین بررسی هایی در ایران که به عنوان یکی از رستنگاه های اولیه یونجه منظور شده و توده های محلی متنوعی دارد مهم است (5، 6، 7). استفاده از هتروزیس و تولید ارقام ساختگی به عنوان یک روش موثر برای اصلاح عملکرد علوفه و سایر صفات مهم زراعی در یونجه پیشنهاد شده است. استفاده از ژنوتیپ هایی با فاصله ژنتیکی و قابلیت ترکیب پذیری مناسب به عنوان والدین هیبرید یا ارقام ساختگی نتایجی با عملکرد بهتر تولید خواهد کرد (2، 3). نشانگرهای مورفولوژیک علیرغم کارایی بالا در تشخیص و طبقه بندی گونه ها، به علت تاثیرپذیری از محیط کارایی کم تری در تعیین میزان تنوع ژنتیکی دارند (3، 32). پیشرفت های علم ژنومیکس علاقه مندی محققین را به استفاده از نشانگرهای ملکولی در شناسایی والدین با فاصله ژنتیکی مناسب جهت تولید ارقام ساختگی و هیبرید در برنامه های اصلاحی افزایش داده است (15، 21، 24، 27). کارایی نشانگرهای ملکولی مختلفی مانند نشانگرهای پروتئینی (4)، RFLP (10، 20، 27)، RAPD (9، 11، 24، 31) AFLP (6، 32)، SSR (13، 17) و EST-SSR (5) برای ارزیابی تنوع و مطالعه ساختار ژنتیکی در جمعیت های یونجه گزارش شده است. از نشانگرهای ISSR (33) نیز در خربزه (2)، سیب زمینی شیرین (21)، توتون (12)، تریتیکاله (16) و گل رز (19) جهت بررسی تنوع و ساختار ژنتیکی استفاده شده است. این نشانگرها مبتنی بر استفاده از توالی های ریزماهواره با یک یا چند باز لنگر در انتهای 3 یا 5 به عنوان آغازگر می باشد و ناحیه بین دو ریزماهواره نردیک به هم در ژنوم را تکثیر می کنند. در این روش نیازی به اطلاعات در مورد توالی ژنومی جهت طراحی آغازگر نمی باشد و هر توالی ریزماهواره با یک یا چند باز لنگر در انتهای 3 یا 5 به عنوان آغازگر استفاده می شود. بازهای لنگر از اتصال آغازگر در داخل توالی ریزماهواره در نقاط مختلف جلوگیری کرده و تعداد مکان های ژنومی تکثیر شده را کاهش می دهد. نشانگرهای ISSR چند مکانی بوده و چند شکلی نسبتاً بالایی را نشان می دهند و ابزار مناسبتی برای تمایز ارقام و جمعیت های گیاهی می باشند. تعداد مکان های تکثیری را می توان با تغییر تعداد و نوع بازهای لنگر تغییر داد (33). هدف از این تحقیق مطالعه ساختار و تنوع ژنتیکی جمعیت های مختلف یونجه، شناسایی جمعیت هایی با فاصله ژنتیکی مناسب و تعیین گروه های هتروتیک در بین ژنوتیپ های مورد مطالعه به عنوان والدین تلاقی برای تولید ارقام ساختگی و هیبرید بود.

مواد و روش ها
مواد گیاهی و استخراج DNA
مواد گیاهی شامل 80 ژنوتیپ از 8 جمعیت قره یونجه ملک کندی، قره یونجه ارومیه، محلی اصفهان، بغدادی، همدانی، آذربایجان اردوبار، ترکیه 1 و ترکیه ساکوئل بود (جدول1). بذور ابتدا در ظروف پتری جوانه دار شده و سپس به گلدان منتقل شدند. پس از رشد گیاهچه ها در گلخانه از هر جمعیت 10 نمونه بطور تصادفی انتخاب و از برگ های سالم و سبز هر گیاه نمونه برداری برای استخراج DNA به روش CTAB (14) انجام گرفت. ارزیابی کیفیت و کمیت DNAی استخراج شده با استفاده از الکتروفورز ژل اگارز یک درصد و اسپکتروفتومتری صورت گرفت DNAهای ژنومی با کیفیت مطلوب برای انجام واکنش های PCR در غلظت 30 نانوگرم در میکرولیتر رقیق شدند.

جدول 1

واکنش زنجیره ای پلیمراز 21 آغازگر ISSR (16، 19، 21) دو و سه نوکلئوتیدی دارای یک یا دو باز انکور در انتهای 3 برای مطالعه تنوع ژنتیکی در بین 80 فرد از 8 جمعیت یونجه استفاده شد (جدول 2). واکنش زنجیره ای پلیمراز از (PCR) در حجم 20 میکرولیتر شامل 45 ناتوگرم DNA، بافر PCR یک برابر (Tris-hcl 10 mM, 50 Mm kcl) (pH =8.3، 5/1 میلی مول MgCI2، 2/0 میکرومول از هر dNTP، 5/0 واحد آنزیم تک پلیمراز و 10 پیکومول از هر آغازگر در ترموسایکلر perkinElmet- Applied Biosystems انجام شد. برنامه دمایی واکنش زنجیره ای پلیمر از بصورت: 4 دقیقه واسرشت سازی اولیه در 94 درجه و 35 چرخه شامل 40 ثانیه در 94 درجه (جهت واسرشت سازی)، 40 ثانیه در 54 درجه (جهت اتصال آغازگرها) و 2 دقیقه در 72 درجه (جهت بسط) و بسط نهایی در 72 درجه به مدت 5 دقیقه بود. تفکیک محصولات تکثیری با استفاده از ژل اگارز 8/1 درصد و بافر TBE نیم برابر با ولتاژ 90 انجام شد و رنگ آمیزی با اتیدیوم بروماید صورت گرفت. شکل یک الگوی باندی آغازگر 848 را روی جمعیت های بغدادی و قره یونجه ملک کندی نشان می دهد.

تجزیه و تحلیل داده ها
امتیازدهی باندها به صورت یک برابر وجود باند و صفر برای عدم وجود باند انجام گرفت. ماتریس صفر و یک برای محاسبه فاصله ژنتیکی نی (25) بین جمعیت ها با استفاده از نرم افزار Gen AIEx نسخه 6 (26) استفاده گردید. تجزیه کلاستر جمعیت ها به روش UPGMA با استفاده ژنتیکی نی، تجزیه کلاستر افراد مورد مطالعه با استفاده از الگوریتم Complete Linkage مبتنی بر ضرایب تشابه دایس برای تعیین گروه های هتروتیک و ضرایب همبستگی کوفنتیک بین ماتریس های فاصله و تشابه و ماتریس های کوفتیک مربوطه با استفاده از نرم افزار NTSYSpc 02/2 (29) محاسبه گردید.

شکل 1

شکل 1- الگوی باندی آغازگر A12 روی جمعیت های محلی اصفهان (10 فرد اول سمت راست نشانگر اندازه) و آذربایجان اردوبار (10 فرد سمت چپ نشانگر اندازه)، نشانگر اندازه OGeneRulerTM (فرمنتاز) یک کیلوباز می باشد.

شکل 2

شکل 2- الگوی آغازگر UBC808 روی جمعیت های محلی اصفهان (10 فرد اول از سمت راست) و آذربایجان اردوبار (10 فرد دوم از سمت راست)، نشانگر اندازه OGeneRulerTM (فرمنتاز) یک کیلوباز می باشد. 

تجزیه واریانس ملکولی (AMOVA) (به منظور برآورد اجزای واریانس بین گیاهان داخل جمعیت ها و بین جمعیت ها و پارامترهای مربوط به ساختار ژنتیکی جمعیت ها از جمله تعداد مکان های اختصاصی جمعیت (23)، تعداد مکان های با فراوانی کمتر از 50 درصد (23) و میانگین هتروزیگوسیتی (18) نیز با نرم افزار GenAIEx نسخه 6 (24) محاسبه شدند. میانگین هتروزیگوسیتی از طریق فرمولpi2 He= l-Σ محاسبه گردید که در این فرمول pi فراوانی آلل iام می باشد.

نتایج و بحث
از 21 آغازگر lssr مورد استفاده 15 آغازگر الگوی باندی مشخص ولی مونومورف تولید کردند (جدول2). 117 مکان توسط آغازگر تکثیر شد که از این تعداد 91 مکان چندشکل (78 درصد) بودند. متوسط مکان های چندشکل برای هر آغازگر 07/6 بود. بالا بودن چندشکلی بدست آمده در پژوهش حاضر را می توان به کارایی بالای روش ISSR، وسعت مناطق جغرافیائی نمونه برداری شده، هتروزیگوسیتی و دگرگشنی یونجه و به تعداد زیاد ژنوتیپ های مورد بررسی نسبت داد (12، 13، 30). همچنین از آنجا که در روش ISSR-PCR آغازگرها مکمل نواحی ریز ماهواره ای می باشند که در یوکاریوت ها با فراوانی بالا در سراسر ژنوم پراکنده اند بنابراین استفاده از این روش می تواند سطح بالایی از چند شکلی را آشکار سازد (33). میزان محتوای اطلاعات چند شکل (PIC) از 65/0 (آغازگر UBC849) تا 93/0 (آغازگر 443) متغیر بود. مقادیر PIC بسیاری از آغازگرهای مورد استفاده زیاد بود که نشان دهنده انتخاب صحیح و کارایی بالای این آغازگرها می باشند (جدول2). مقادیر بالای PIC و چند شکلی برای آغازگرهای ISSR در مطالعات دیگری نیز گزارش شده است (2، 19). میزان PIC به عواملی مانند تعداد آلل های هر جایگاه، محتوای نوکلئوتیدی آغازگرهای انتخاب شده بستگی دارد که در این مطالعه آغازگرهای مورد استفاده براساس مطالعات قبلی انتخاب شده بودند (15، 18، 20) و سعی شده بود آغازگرهایی انتخاب شوند که میزان چند شکلی بالایی در مطالعات قبل نشان داده بودند که این می توان توجیه کننده مقادیر بالای PIC در این مطالعه باشد. در کل آغازگرهای با توالی دو نوکلئوتیدی PIC و تعداد مکان هاب چند شکل زیادی تولید کردند. دامنه اندازه باندی مکان های تکثیر شده از 250 تا 4500 جفت باز متغیر بود (جدول2). درصد مکان های چند شکل در جمعیت ها از 39/62 درصد (جمعیت ترکیه 1) تا 23/69 درصد (جمعیت های ترکیه ساکوئل و محلی اصفهانی) متغیر بود (جدول 3). فراوانی همه مکان های تکثیر شده بیش از 50 درصد بود که بیانگر شایع بودن مکان های تکثیر شده در جمعیت های مورد مطالعه می باشد. میانگین هتروزیگوسیتی از 267/0 (بغدادی) تا 309/0 (ترکیه ساکوئل و محلی اصفهانی) متغیر بود. متوسط میانگین هتروزیگوسیتی 285/0 بود که با توجه به میزان دگرگرده افشانی و هتروزیگوسیتی زیاد یونجه این سطح از تنوع قابل انتظار بود (25، 26). فاصله ژنتیکی نی بین جمعیت ها از 054/0 (ترکیه ساکوئل و بغدادی) تا 128/0 (قره یونجه ملک کندی و همدانی) متغیر بود. بالا بودن دامنه فاصله ژنتیکی نشان از تنوع بالای جمعیت های مورد مطالعه می باشد و از جمعیت هایی با فاصله ژتتیکی زیاد می توان به عنوان والدین تلاقی در برنامه های اصلاحی یونجه استفاده کرد. تجریه کلاستر به روش UPGMA جمعیت ها را در سه گروه اصلی (شکل2) قرار داد. جمعیت قره یونجه ملک کندی به تنهایی در گروه اول قرار گرفت. گروه دوم شامل دو زیر گروه بود. زیرگروه اول شامل جمعیت های ترکیه ساکوئل، بغدادی، ترکیه 1 و آذربایجان اردوبار و زیر گروه دوم شامل جمعیت های محلی اصفهانی و همدانی بود. سه جمعیت خارجی در زیرگروه مشابهی قرار گرفتند. جمعیت قره یونجه ارومیه نیز همانند جمعیت قره یونجه ملک کندی به تنهایی در گروه سوم قرار گرفت. با توجه به فاصله جغرافیایی زیاد دو جمعیت قره یونجه از دیگر جمعیت های مورد مطالعه، قرار گرفتن آنها در گروهای جداگانه قابل انتظار بود. نتایج حاصل از تجزیه کلاستر با تجزیه به مختصات اصلی (PCO) نیز تایید شد (شکل3). در تجزیه به مختصات اصلی مولفه های اول و دوم به ترتیب 34 و 21 درصد کل تنوع موجود در جمعیت های مورد مطالعه را توجیه می کردند. برای ارزیابی تنوع ژنتیکی درون و بین جمعیت ها، تجزیه واریانس ملکولی (AMOVA) براساس جمعیت های مورد مطالعه انجام شد. نتایج بدست آمده نشان داد که اختلاف معنی داری (P<O.010) درون جمعیت ها وجود دارد و تنوع ژنتیکی درون جمعیت ها (91 درصد) در مقایسه با بین جمعیت ها (9 درصد) بیشتر می باشد. تنوع زیاد درون جمعیتی حاصل از این مطالعه احتمالا به خاطر هتروزیگوسیتی و دگرگشنی یونجه و قابلیت بالای آشکارسازی چند شکلی توسط نشانگر ISSR می باشد (1، 24، 28، 30).

جدول 2

جدول 2- توالی آغازگرهای ISSR استفاده شده، تعداد کل مکان های تکثیر شده، مکان های چند شکل، محتوای اطلاعات چند شکل (PIC) و دامنه اندازه باندی 

جدول 3

جدول 3- خصوصیات مکان های ISSR تکثیر شده در جمعیت های یونجه مطالعه شده


شکل 2- دندروگرام 8 جمعیت یونجه تتراپلوئید مبتنی بر ضرایب فاصله ژنتیکی نی به روش UPGMA حاصل از 16 آغازگر ISSR (GHM: قره یونجه ملک کندی، TuS: ترکیه ساکوئل، Bagh: بغدادی، TUI: ترکیه 1، AOrd: آذربایجان اردوبار، MEs: محلی اصفهانی، Ham: همدانی و GhO: قره یونجه ارومیه)


شکل 3- نمودار دو بعدی روابط ژنتیکی بین 8 جمعیت یونجه تتراپلوئید حاصل از تجزیه به مختصات اصلی (GhM: قره یونجه ملک کندی، TuS: ترکیه ساکوئل، Bagh: بغدادی، ترکیه 1، آذربایجان اردوبار، MEs: محلی اصفهانی، Ham: همدانی و GhO: قره یونجه ارومیه)

اگرچه نشانگرهای ISSR تا حدودی جمعیت های مورد مطالعه را متمایز ساخت ولی میزان تمایز کلی بین جمعیت های مورد بررسی پایین بود (p=0/01 و 089/0 phiT). تمایز پایین بین جمعیت ها در مطالعه حاضر احتمالاً به خاطر جریان ژنی و مهاجرت زیاد بین جمعیت ها می باشد. تمایز کم و مهاجرت و جریان ژنی زیاد بین جمعیت های یونجه تتراپلوئید ایران در مطالعات قبلی نیز گزارش شده است (5، 17). با توجه به وجود تنوع ژنتیکی بالای درون جمعیت ها، گروه های هتروتیک جهت شناسایی والدین هیبریدها (8) در بین 80 ژنوتیپ مورد مطالعه با استفاده از تجزیه کلاستر به روش Complete linkage مبتنی بر ضرایب تشابه دایس تعیین شد. ژنوتیپ ها در سه گروه اصلی قرار گرفتند (شکل4) و هر کدام از گروه های اصلی نیز شامل دو زیر گروه بودند که می توانند معرف گروه های هتروتیک (جدول4) باشند. کمترین تشابه ژنتیکی (543/0)، بین ژنوتیپ های قره یونجه ارومیه 7 (GhO7) و قره یونجه ملک کندی 2 (GhM2) و بیشترین تشابه ژنتیکی (863/0)، بین ژنوتیپ های محلی اصفهانی 3 (MEs3) و ترکیه 3 (Tul.3) مشاهده شد. میانگین تشابه ژنتیکی بین ژنوتیپ ها 696/0 بود. می توان از ژنوتیپ های مربوط به گروه های هتروتیک متفاوت به عنوان والدین تلافی در برنامه های اصلاحی تولید هیبرید یا سمی هیبرید برتر بهره گرفت. البته فاصله ژنتیکی تنها عامل موثر در شناسایی والدین منایب برای تولید هیبرید نیست و بایستی فاکتورهای دیگری مانند قابلیت ترکیب پذیری و فاصله ژنتیکی بر اساس صفات مورفولوژیک را نیز در نظر گرفت (8، 9)، مطالعات مختلف حکایت از نتایج متناقض کاربرد تنوع ژنتیکی براساس نشانگرهای ملکولی در انتخاب والدین هیبریدها و ارقام ساختگی دارد (22) بطوری که تخمین دقیق عملکرد نتایج در بسیاری از موارد با مشکل مواجه بوده است. شاید این مسئله را بتوان به عدم پیوستگی ژن های مورد علاقه به نشانگرها. ناسازگاری افراد انتخاب شده جهت تلافی و خطاهای مربوط به نشانگرهای ملکولی نسبت داد (10، 13). با این حال با کشف وجود رابطه بین فاصله ژنتیکی و عملکرد علوفه در یونجه تتراپلوئید (3)، این امید پیدا شده است که نشانگرها می توان در برنامه های اصلاحی یونجه برای شناسایی متنوع ترین ژنوتیپ ها به عنوان والدین ارقام ساختگی و هیبریدها استفاده شوند (15). با توجه به نتایج بدست آمده از این پژوهش و با مطالعات تکمیلی (مطالعه صفات مورفولوژیک و استفاده از نشانگرهای مبتنی بر توالی ژن ها) می توان از جمعیت های مربوط به گروهای مختلف و ژنوتیپ های متعلق به گروه های هتروتیک متفاوت به عنوان والدین جهت تولید هیبرید، سمی هیبرید و ارقام سنتتیک در یونجه استفاده کرد. همچنین نتایج پژوهش حاضر نشان می دهد که تنوع ژنتیکی بالای درون جمعیت های یونجه مورد مطالعه، برای انجام برنامه های اصلاحی و دورگ گیری جهت افزایش عملکرد، کیفیت و سازگاری این گیاه مناسب می باشد و به نظر می رسد که روش ISSR به همراه روش های آماری چند متغیره مانند تجزیه کلاستر پتانسیل قابل توجهی جهت بررسی روابط خویشاوندی و تنوع ژنتیکی یونجه های تتراپلوئید را داراست. پیشنهاد می شود برای اطمینان از نتایج حاصله از نشانگرهای مختلف و همچنین از تعداد زیادی آغارگر بویژه آغازگرهایی که نشانگرهای پیوسته با صفات زراعی مهم تولید می نمایند در مطالعات آتی استفاده شود. 


شکل 4- دندروگرام 80 ژنوتیپ یونجه تتراپلوئید به روش Complete linkage مبتنی بر ضرایب تشابه دایس حاصل از 16 آغازگر ISSR (GhM: قره یونجه ملک کندی، TuS: ترکیه ساکوئل، Bagh: بغدادی، TUI: ترکیه 1، AOrd: آذربایجان اردوبار، MEs: محلی اصفهانی، Ham: همدانی و GhO: قره یونجه ارومیه) 

منابع
1. رضایی م، تقوی م ر، معالی امیری ر (1389) ارزیابی تنوع ژنتیکی در اکوتیپهای یونجه زراعی (Medicago sativa l..)  نواحی مرکزی و شرقی ایران با استفاده از نشانگرهای ریزماهواره، مجله علوم زراعی ایران، ش 4: 532-520 
2. فابریکی اورنگ ص، شمس بخش م، جلالی جواران م، احمدی ج (1388) بررسی تنوع ژنتیکی توده های بومی خربزه ایرانی با استفاده از نشانگرهای ملکولی بین ریزماهواره ای (ISSR)، مجله زیست شناسی ایران، ج22، ش2: 167-177 
3. فرشادفر م، فارغی ش، فرشادفر ع، و جعفری ع (1387) ارزیابی تنوع ژنتیکی یونجه با استفاده از شاخص های ریخت شناسی و شیمیایی، فصلنامه علمی- پژوهشی تحقیقات ژنتیک و اصلاح گیاهان مرتعی و جنگلی ایران، ش16: 1-13
4. مانوس ح، ولیزاده م، زهتاب سلماسی س، اهری زاد س، و سلوکی م (1389) بررسی تنوع ژنتیکی در ارقام بومی و سنتیک یونجه با نشانگرهای پروتئینی بذر، مجله علوم گیاهان زراعی ایران، ش41: 113-121
5. Bahar M. Ghobadi S. Erfani Moghadam V, Yamchi A, Talebi Bodaf M. Kaboli MM and Mokhtarzadeh AA (2006) Evaluation of genetic diversity in lranian alfalfa populations using EST-SSRs. Sciences and techniques in agriculture and natural resources 2:141-153
6. Barcaccia G. Albertin E, Tavoletti S. Falcinelli M and Veronesi F (1999) AFLP fingerprinting in Medicago spp: its development and application in linkage mapping mapping. Plant Breeding. 118:335-341
7. Barcaccia G, Tosti N, Falistocco E and Veronesi f (1995) Gytologcal, morphological and molecular analysis of controlled progenies from meiotic mutants of alfalfa producing unreduced gametes. Theor Appl Genet 91:1008-1015.
8. Brummer EC (1999) Capturing hetrosis in forage crop culinary development. Crop Science, 32:939-943.
9. . Brummer EC Bouton JH and Kochert G (1995) Analysis of annual Medicaogo species using RAPD markers. Genome, 38:362-367
10. Brummer EC, Kochert Gand Bouton JH (1991) RFLP variation in diploid and tetraploid alfalfa. Theor Appl Genet, 83:89-96
11. Crochemore MI., Huyghe C, Kerlan MC and Julier B 11. Crochemore MI., Huyghe C, Kerlan MC and Julier B (1996) partitonong and distribution of RAPD variation in a set of populations of Medicago sativa complex. Agronomie,  16:421-432.
12. Denduangboripant j, Setaphan S, Suwanprasart w and 12. Denduangboripant j, Setaphan S, Suwanprasart W and panha S (2010) Determination of local tobacco cultivars. Using ISSR molecular markers. Chiang Mai j. Sci, 37:293-303 
13. Diwan N, Bhagwat AA, Bauchan GR and Cregan PB (1997) Simple sequence repeat DNA markers in alfalfa and perennial and annual Medicago species. Genome 40:887-895
14. Doyle JJ and Doyle JL (1990) lsolation of plant DNA from fresh tissue. Focus, 12:13-15
15. Echt CS, Kidwell KK, Knapp SJ. Obsorn TC and McCoy TJ (1993) Linkage mapping in diploid alfalfa (Medicago Sativa). Genome, 37:61-71
16. Emel S (2010) Evaluation of ISSR markers to assess genetic variability and relationship among winter triticale (x triticosecale wittmack) cultivars. Pak. J. Bot. 42:2755-2763
17. falahati- Anbaran M, Habashi AA, Esfahani M, Mohammadi SA and Gharayazi B (2007) Population genetic structure based on SSR markers in alfalfa (Medicago sativa L.) from various regions contiguous to the centres of origin of the species. Journal of Genetics l:59-63
18. Hartl DL, Clark AG (1997) Principles of Population Genetics 3rd Ed, Sunderland, Massachusetts: Sinauer Associates, lnc. 
19. Jabbarzadeh Z, Khosh-khui M, salehi H and saberivand A (2010) lnter simple sequence repeat (ISSR) markers as reproducible and specific tools for genetic analysis of rose species. African journal of biotechnology, 37:6091-6095.
20. kidwell KK, Austin DF and Osborn TC (1994) RFLP evaluation of nine Medicago populations representing the original germplasm sources for norte American alfalfa cultivars. Crop Sci, 34:230-236.
21. Li Q, Liu QC, Zhai H, Ma DF, Wang X, Li XO and Wang YP (2008) Genetic diversity in main parents of sweetpotato in china as revealed by ISSR Markers. Acta Agron Sin, 34 (6): 972-977.
22. Liu ZQ, pel Y and pu ZJ (1999) Relationship between hybrid performance and genetic diversity based on RAPD markers in wheat, Triticum aestivum L. plant Breeding, 118:119-123
23. Maguire TL, Peakall R, Saenger p (2002) Comparative analysis of genetic diversity in the mangrove species Avicennia marina Vierh. (Avicenniaceae) detected by AFLPS and SSRs. Theoretical and Applied Genetics, 104:388-398.
24. Mengoni A, Gori A and Bazzicalupo M (2006) Use of RAPD and microsatellite (SSR) variation to assess genetic relationships among populations of tetraploid alfalfa, Medicago sativa, plant Breeding, 119:113-117
25. Nei M and Li WH (1979) Mathematical model for studying genetic variation in terms of restriction endonucleases, proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 76:5269-5273.
26. Peakall R and Smouse PE (2006) GenALEx 6: Genetic Analysis in Excel. Population genetic software for leaching and research, Molecular Ecology Notes, 6: 288-295
27. Pupilli f, Businelli S, Paolocci f, Scotti C, Damiani f and Arcioni S (1996) Extent of RFLP variability in tetraploid populations of alfalfa, Medicago sativa. Plant Breeding. 115:106-122
28. Rezae A (1994) alfalfa Breeding. University publication Center (Markaze Nashr Daneshghahi). Tehran. 
29. Rohlf FJ (1998) NTSYSps, Numerical taxonomy and multivariate analysis system. Applied Biostatistics. lnc., New York.
30. Veronesi f. Charles B and Huyghe C (2010) Alfafa. Springer Sci, 395-436
31. Yu P and pauls Kp (1993) Rapid estimation of genetic relatedness among heterogeneous populations of alfalfa by random amplification of bulked genomic DNA samples. Theor Appl Genet, 86:788-794
32- Zaccardelli M, Gnocchi S, Carelli M and Scotti C (2003) Variation among and within ltalian alfalfa ecotypes by means of bio- agronomic characters and amplified fragment length polymorphism analyses. Plant Breeding, 122: 61-65.
33. Zietkiewicz E, Rafalski A, Labuda D (1994) Genome fingerprinting by simple sequence repeat (SSR)-anchored polymerase reaction amplification. Genomics 20, 176-183.


اشتراک

دیدگاه دیگران (بدون دیدگاه)...

Leave a reply

نام:: فیلد اجباری.
آدرس رایانامه: فیلد اجباری. غیر فعال
وبسایت::
کد امنیتی:: فیلد اجباری.
دیدگاه: فیلد اجباری.